熒光顯微鏡用于研究化學(xué)物質(zhì)在細(xì)胞中的吸收、運(yùn)輸、分布和定位。被測(cè)物體產(chǎn)生熒光有兩種形式：自發(fā)光。紫外線照射后直接發(fā)出的熒光稱為二次熒光。經(jīng)過(guò)熒光染料處理和紫外線照射后，可以發(fā)出熒光。細(xì)胞中的一些物質(zhì)，如葉綠素，在紫外線照射后會(huì)產(chǎn)生自發(fā)光。雖然其他物質(zhì)本身沒(méi)有熒光，但它們可以通過(guò)熒光染料或熒光抗體染色發(fā)出二次熒光。
熒光顯微鏡選擇發(fā)光效率高的點(diǎn)光源，發(fā)射一定波長(zhǎng)的光(紫外線365nm或紫藍(lán)光420nm)作為一種激發(fā)光，它會(huì)激發(fā)標(biāo)本中的熒光物質(zhì)，發(fā)出各種顏色的半透明光，然后通過(guò)物鏡和目鏡的放大來(lái)觀察。在如此強(qiáng)烈的對(duì)比環(huán)境中，即使半透明光很弱，也很容易識(shí)別，并且具有很高的靈敏度。它主要用于研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能和化學(xué)成分。
熒光顯微鏡可分為散射顯微鏡和下降顯微鏡兩種類型。前者是原始的，后者是先進(jìn)的。兩種熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)相似，主要區(qū)別如下：散射激發(fā)光通過(guò)標(biāo)本，整個(gè)標(biāo)本產(chǎn)生光，然后進(jìn)入物鏡，放大率越大，光越弱;入射激發(fā)光投射到樣品表面，樣品表面產(chǎn)生光，然后光進(jìn)入物鏡。放大率越大，光線越高，適合高倍數(shù)觀察。
熒光顯微鏡的主要部件包括汞燈源、興奮過(guò)濾器、分色鏡(脫落)、抑制過(guò)濾器、暗場(chǎng)聚光燈(散射)等。此外，由于汞燈的嚴(yán)重加熱，其中大多數(shù)都配備了吸熱過(guò)濾器。一些熒光顯微鏡也有相位差鏡和環(huán)狀闌尾，因此可以觀察到相位差。熒光顯微鏡選擇倒置框架、倒置顯微鏡等。
此外，上述所有顯微鏡有顯微鏡CCD組裝成數(shù)字顯微鏡，將顯微鏡看到的物理圖像轉(zhuǎn)換成數(shù)字圖像，并在計(jì)算機(jī)上顯示圖像。因此，我們可以通過(guò)傳統(tǒng)的雙眼觀察和顯示屏上的再現(xiàn)來(lái)研究微領(lǐng)域，從而提高工作效率。
在金相顯微鏡的使用過(guò)程中，想要觀察到金屬破壞的斷口就要磨平，拋光并且加化學(xué)藥水酸洗之后才能看到。
一、過(guò)程： 簡(jiǎn)單地說(shuō)分為:取樣→鑲嵌→磨光與拋光→侵蝕→觀察照相等五個(gè)步驟。
二、注意事項(xiàng)：
a) 金相試片只應(yīng)在砂輪側(cè)面輕輕地磨制。當(dāng)試片的厚度小于10mm 時(shí)，應(yīng)在鑲嵌后再進(jìn)行打磨。
b) 嚴(yán)禁在磨片機(jī)旋轉(zhuǎn)時(shí)更換砂紙、砂布。
c ) 試片打磨，拋光時(shí)應(yīng)拿緊，并力求與磨面接觸平穩(wěn)。兩人不得同時(shí)在一個(gè)旋轉(zhuǎn)盤上操作。
d) 腐蝕、電解金相試片的化學(xué)藥品試劑應(yīng)按其性質(zhì)分類儲(chǔ)存和保管，配制、使用時(shí)應(yīng)遵守有關(guān)規(guī)定；進(jìn)行電解時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格控制電解液的溫度及電流密度。
e) 金相腐蝕、電解的操作室應(yīng)通風(fēng)良好，并設(shè)有自來(lái)水和急救酸、堿傷害時(shí)中和用的溶液。
f) 金相試驗(yàn)用過(guò)的廢液應(yīng)經(jīng)必要的處理后方可排放，不得將未經(jīng)處理的廢料倒入下水道。
g) 現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行金相試驗(yàn)時(shí)應(yīng)有防止試劑、溶液潑灑滴落的措施；作業(yè)完畢后應(yīng)將雜物、廢液清理干凈。
h) 更換臥式金相顯微鏡的弧光電極時(shí)要切斷電源。
①在使用光學(xué)顯微鏡時(shí)，先留意顯微鏡總體安裝是不是有松脫，例如，光學(xué)顯微鏡長(zhǎng)期被使用，將會(huì)形成支撐架松脫、物鏡安裝太松等難題。那樣太松會(huì)危害檢驗(yàn)實(shí)踐效果，還十分容易破壞光學(xué)顯微鏡。
②運(yùn)用準(zhǔn)焦螺旋的常見(jiàn)問(wèn)題。在操作過(guò)程全過(guò)程中十分容易在高倍鏡下立刻對(duì)焦，或是無(wú)論鏡筒升高或降低，雙眼自始至終在往目鏡中看視野，或是不是控制物距的臨界點(diǎn)，物距調(diào)到２～３公分時(shí)還要往上漲，并且旋轉(zhuǎn)準(zhǔn)焦螺旋式的速率疾速。這種難題都十分容易形成成物鏡攝像鏡頭惡感到裝片，損傷裝片或攝像鏡頭。關(guān)于之上實(shí)踐操作難題，小編想說(shuō)，在調(diào)整鏡頭焦距時(shí)一定要在低倍鏡降落，先旋轉(zhuǎn)粗準(zhǔn)焦螺旋，使鏡筒慢慢地降低，物鏡挨近蓋玻片，但留意不用讓物鏡遇到蓋玻片，在這個(gè)全過(guò)程中雙眼要從側(cè)邊看物鏡，隨后用右眼朝目鏡內(nèi)注視，并慢慢地反方向調(diào)整粗準(zhǔn)焦螺旋，使鏡筒冉冉上升，直至見(jiàn)到虛像才行，另外向?qū)W員標(biāo)明普通光學(xué)顯微鏡的物距在１公分上下，因而假設(shè)物距已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越１公分，但并未見(jiàn)到虛像，那可能是標(biāo)本采集未在視野內(nèi)或旋轉(zhuǎn)粗準(zhǔn)焦螺旋速率過(guò)快，這時(shí)應(yīng)調(diào)理裝片部位，隨后再重復(fù)所述流程，當(dāng)視野中出現(xiàn)含糊不清的虛像時(shí)，就需求換用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋調(diào)整，只能那樣，才能夠變小找尋范疇，提升尋覓虛像的速率。
③光學(xué)顯微鏡對(duì)光線的難題。對(duì)光線是應(yīng)用光學(xué)顯微鏡時(shí)很重要的一步，謹(jǐn)記，一定要用低倍鏡對(duì)光線，當(dāng)光源較強(qiáng)時(shí)用小焦距、平面鏡，而光源較差的時(shí)分用大光圈鏡頭、凹面鏡，旋轉(zhuǎn)后視鏡時(shí)不能用一只手就將后視鏡扳出來(lái)，要用兩手旋轉(zhuǎn)，當(dāng)見(jiàn)到勻稱亮堂的環(huán)形視野才行。光對(duì)好后千萬(wàn)別隨意移動(dòng)光學(xué)顯微鏡，以防光源不能夠**地依據(jù)后視鏡進(jìn)到通光線的孔子。
④物鏡變換的難題。應(yīng)用低倍鏡后改用高倍鏡，大家通常喜歡用手指立刻推轉(zhuǎn)物鏡，覺(jué)得那樣較為省勁，但那樣十分容易使物鏡的光軸產(chǎn)生傾斜，原因是轉(zhuǎn)化器的原資料色澤過(guò)軟，精細(xì)度較高，外螺紋支承不勻稱十分容易松動(dòng)。一旦外螺紋破壞，全部轉(zhuǎn)化器便會(huì)報(bào)費(fèi)。因此小編建議大家手握著轉(zhuǎn)化器的下一層旋轉(zhuǎn)板變換物鏡。
⑤高倍光學(xué)顯微鏡用眼的難題。用高倍顯微鏡物鏡時(shí)，右眼要盡可能接近目鏡，右眼嘗試向視野內(nèi)注視，不要用力捂著右眼或果斷閉上右眼，它是不符實(shí)驗(yàn)的觀查規(guī)則的，常常那樣右眼容易疲倦，另外也不能夠保證邊觀查邊繪圖。
視頻顯微鏡的聚光器也叫集光器，由聚光鏡和可變光闌組成。聚光鏡由一片或數(shù)片透鏡組成，其作用相當(dāng)于凸透鏡，起聚光的作用，以增強(qiáng)射入物鏡的光線?？勺児怅@也叫光圈，位于聚光鏡的下方，由十幾片金屬薄片組成，中心部呈圓孔。推動(dòng)可變光闌的把手可以任意調(diào)節(jié)孔徑的大小，其作用是通過(guò)調(diào)節(jié)光強(qiáng)度，使聚光鏡的數(shù)值孔徑和物鏡的數(shù)值孔徑相一致。可變光闌開得越大，則數(shù)值孔徑越大；反之，則數(shù)值孔徑越小。
視頻顯微鏡的反光鏡一般裝在聚光器下方的鏡座上，可以在水平和直方向任意旋轉(zhuǎn)。它的一面是平面鏡，另一面是凹面鏡，其作用是使光源發(fā)出的光或自然光射向聚光鏡。光強(qiáng)時(shí)用平面鏡，光弱時(shí)用凹面鏡。有的顯微鏡的人工光源安裝在鏡座內(nèi)，其反光鏡也固定在鏡座內(nèi)。
由單透鏡構(gòu)成的放大鏡和由透鏡組成的實(shí)體顯微鏡(解剖鏡)稱單式顯微鏡生物學(xué)教學(xué)及科研所用的光學(xué)顯微鏡一般是復(fù)式顯微鏡。
由外界入射的光線經(jīng)反光鏡反射向上，或由內(nèi)光源發(fā)射的光線經(jīng)集光鏡向上，再經(jīng)聚光鏡會(huì)聚在被檢標(biāo)本上，使標(biāo)本得到足夠的照明，由標(biāo)本反射或折射出的光線經(jīng)物鏡進(jìn)入使光軸與水平面傾斜45
度角的棱鏡，在目鏡的焦平面上，即在目鏡的視場(chǎng)光闌處，成放大的側(cè)光實(shí)像，該實(shí)像再經(jīng)目鏡的接目透鏡放大成虛像，所以人們看到的是虛像。
被檢物體經(jīng)顯微鏡的物鏡和目鏡放大后的總放大倍數(shù)是物鏡的放大倍數(shù)和目鏡放大倍數(shù)的乘積。如用放大40倍的物鏡和放大10倍的目鏡的總放大倍數(shù)是400倍。
當(dāng)視頻顯微鏡放大倍數(shù)增加時(shí)，一方面由于放大倍數(shù)越高，透鏡數(shù)目越多，被透鏡吸收的光線也越多;另一方面由于視場(chǎng)(指的是所能看到被檢標(biāo)本的范圍)的亮度與放大倍數(shù)的平方成反比，即放大倍數(shù)越高，視場(chǎng)越暗。為了得到足夠的亮度，必須安裝聚光器，把光線集中到所要觀察的標(biāo)本上。
觀察時(shí)視頻顯微鏡的聚光器該處的高度
觀察時(shí)，要保證得到*好的觀察效果，聚光器的聚光焦點(diǎn)應(yīng)正好落在標(biāo)本上。要實(shí)現(xiàn)這個(gè)條件，就必須調(diào)節(jié)聚光器的高度。當(dāng)用平行光照明時(shí)，聚光器的聚光焦點(diǎn)是在它上端透鏡平面中心上方約1.25mm之處，因此，人們常常要求在觀察時(shí)將聚光器上升到它上端透鏡平面僅稍稍低于載物臺(tái)平面的高度，這樣聚光焦點(diǎn)就可能落到位于標(biāo)準(zhǔn)厚度載玻片上的標(biāo)本上。當(dāng)使用比標(biāo)準(zhǔn)厚度薄的載玻片來(lái)承放標(biāo)本時(shí)，聚光器的位置要相應(yīng)地降低一些，而當(dāng)使用過(guò)厚地載玻片時(shí)，聚光焦點(diǎn)只能落在標(biāo)本下方，不利于精細(xì)的觀察。
視頻顯微鏡的聚光器應(yīng)與物鏡配合使用
這里所謂的配合，指的就是使視頻顯微鏡的聚光器和物鏡這兩者的數(shù)值孔徑取得一致，以更好的進(jìn)行較為精細(xì)的觀察。假如聚光器的數(shù)值孔徑低于物鏡，那物鏡的部分?jǐn)?shù)值孔徑就浪費(fèi)了，從而達(dá)不到它的*高分辨率。假如把聚光器的數(shù)值孔徑大于物鏡的數(shù)值孔徑，則一方面不能提高物鏡的規(guī)定分辨力，另一方面反會(huì)由于照明光束過(guò)寬，使物象的清晰度下降。聚光器與物鏡配合的操作方法是：在完成照明、調(diào)焦操作后，取下目鏡直接向鏡筒中看，把聚光器下的可變光闌關(guān)到*小，再慢慢地開大。開到它的口徑與所見(jiàn)視場(chǎng)的直徑恰好一樣大，然后按上目鏡，即可進(jìn)行觀察。每轉(zhuǎn)換一次物鏡，都要隨著進(jìn)行依次這樣的配合操作。有的聚光器可變光闌的邊框上刻有表示開啟口徑的尺度，可以根據(jù)刻度來(lái)進(jìn)行配合。
在顯微鏡光源故障維修中，發(fā)現(xiàn)其中有一部分用戶(約25%)因?qū)︼@微鏡光源系統(tǒng)缺乏了解，把本可以自己解決光源故障的顯微鏡，從很遠(yuǎn)的地方送來(lái)或寄到單位維修。不僅費(fèi)時(shí)，而且費(fèi)力、費(fèi)錢。為了讓這部分顯微鏡使用用戶，不再跑冤枉路、花冤枉錢，先向大家介紹一下遇到顯微鏡光源故障時(shí)的維修方法：
1、檢查燈泡是否燒壞。約10%的用戶因有些燈絲燒壞肉眼很難辨別而把顯微鏡拿來(lái)廠家修理。
2、檢查保險(xiǎn)絲是否燒壞。約5%的用戶因有些保險(xiǎn)絲燒斷后很難用肉眼判別而退到修理。正確檢查方法是用萬(wàn)用表電阻檔檢測(cè)保險(xiǎn)絲是否良好
3、檢查顯微鏡燈泡插座是否因溫度高表面氧化而造成接觸不良。約7%的用戶因燈泡插座表面氧化而把顯微鏡拿來(lái)修理，正確的檢查方法是取下燈泡，用細(xì)沙紙或者小刀片打磨刮去燈座表面的氧化層，然后裝回?zé)襞輽z查燈座是否接觸良好。
4、檢查電源插座接觸是否良好。約3%的用戶把光源沒(méi)有問(wèn)題的顯微鏡拿來(lái)廠家維修，結(jié)果在插上電源，顯微鏡光源正常。
在使用顯微鏡時(shí)首先應(yīng)該考慮的是你需要觀察什么內(nèi)容，希望得到什么觀察/拍攝效果，然后才能決定采用什么類型的顯微鏡。如果想達(dá)到*理想的明視野顯微鏡的效果指顯微鏡應(yīng)達(dá)到的*佳分辨率)而顯微鏡上用的卻是消色差或相差物鏡，或所使用的聚光器的數(shù)值孔徑只有1.2(阿貝聚光器)那么無(wú)論怎樣努力，也不可能拍出*好的照片(指用油鏡工作時(shí))。
所以，拍攝前應(yīng)檢查確定所使用的顯微鏡類型及組件是否匹配，調(diào)整方法是否正確，這是至關(guān)重要的，一般來(lái)講，確定所使用的顯微鏡方法是否正確，應(yīng)先看物鏡的類型，再查聚光器用的是否正確，然后再核實(shí)是否符合柯勒照明條件。
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